高通量基因組測序等三項革命性技術(shù)服務(wù)于醫(yī)療領(lǐng)域勢不可擋！

  隨著人們探索和操控基因組技術(shù)的進(jìn)步，生物醫(yī)學(xué)也迎來了前所未有的發(fā)展機(jī)遇。在過去，人們形容新事物發(fā)展速度喜好用“火箭”般，而如今測序技術(shù)的推進(jìn)，醫(yī)療技術(shù)也正以“基因”數(shù)據(jù)的遞增速度而快速進(jìn)步。

  安永預(yù)測的2020年醫(yī)療服務(wù)模式

 美國杰克遜實驗室(The Jackson Laboratory)建立于1929年，是一個非贏利性的獨立研究機(jī)構(gòu)。80多年以來，杰克遜實驗室的科學(xué)家們一直從事基于小鼠的生物醫(yī)學(xué)研究，并在小鼠的繁育、小鼠遺傳學(xué)和在研究中如何選擇運用實驗小鼠方面積累了大量的寶貴知識和經(jīng)驗。

  作為世界最大的遺傳基因工程研究中心，杰克遜實驗室認(rèn)為：有三項技術(shù)正在勢不可擋地服務(wù)于制藥和醫(yī)療領(lǐng)域，依次是：高通量基因組測序，CRISPR基因編輯和單細(xì)胞基因組學(xué)。借助于上述技術(shù)，科學(xué)家們逐漸揭開了蘊藏于人體的DNA的奧秘，并試圖溯源復(fù)雜疾病的本質(zhì)。本文主要從它們?nèi)绾纬霈F(xiàn)?如何工作?以及如何改變生物醫(yī)學(xué)進(jìn)程三個方面來闡述這3大技術(shù)。

  高通量基因組測序

  如何出現(xiàn)?

  人體的基因有30億個堿基對，由堿基對排列差異造成了人與人之間的差異。為了發(fā)現(xiàn)這些差異，科學(xué)家發(fā)明了儀器來讀取A、G、C、T的意義。尤其是高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序。

  2005年，454公司首先推出了二代測序儀;2006年，Solexa推出了Genome Analyzer;2007年年初Illumina收購了Solexa公司，在隨后的幾年陸續(xù)推出了Hiseq、MiSeq、NextSeq等多種系列測序儀;ABI推出了SOLiD測序平臺，隨后收購了454測序儀發(fā)明者創(chuàng)立的Ion Torrent，轉(zhuǎn)而大力推廣PGM和Ion Proton平臺;2014年，也就是高通量測序技術(shù)發(fā)展的第十年，Illumina公司的Hiseq X平臺已經(jīng)實現(xiàn)了1000美金一個人類基因組測序的目標(biāo)。2015年，華大子公司CG推出新款“超級測序儀”Revolocity?，該系統(tǒng)結(jié)合了Complete Genomics新一代測序技術(shù)和操作經(jīng)驗，可以對人全血、唾液等各種樣本進(jìn)行自動化的DNA提取。

  如何工作?

  高通量基因組測序主要包括樣本準(zhǔn)備(sample fragmentation)、文庫構(gòu)建(library preparation)、測序反應(yīng)(sequencing reaction)、數(shù)據(jù)分析(data analysis)。由于具體操作已經(jīng)是人盡皆知，在此不贅述。

  如何改變生物醫(yī)學(xué)進(jìn)程?

 高通量測序(NGS)從興起到現(xiàn)在已有10余年的時間，但其成本下降依舊只是這幾年的事情。隨著成本的不斷下降，高通量DNA測序平臺已經(jīng)發(fā)展為基因組和各種基因文庫序列檢測的強大工具。大容量的抗體基因庫是目前獲得抗體新藥的基礎(chǔ)，高通量DNA測序技術(shù)為從海量的抗體基因庫中快速發(fā)現(xiàn)功能抗體分子提供了可能。

 NIH統(tǒng)計的讀取DNA序列成本

  1000美金價格的實現(xiàn)比十年前的30億美金降低了300萬倍。除此以外，還有一些公司開發(fā)了第三代測序儀，比如Pacific Biosciences的PacBio RS測序儀，DNA模板無需二代測序常用的PCR擴(kuò)增的方法，就可以實現(xiàn)長讀長、實時的測序;Oxford Nanopore MinION測序儀只有USB存儲器那么大等等。

  NIH統(tǒng)計的基因組測序價格

  隨著高通量測序的普及，全基因組測序?qū)⒃絹碓狡毡?花更少的時間和金錢)，基于NGS平臺展開的各類醫(yī)療服務(wù)，猶如基于ios系統(tǒng)的APP，在一個較小的平臺上，可以按需使用相關(guān)的檢測，實現(xiàn)大規(guī)模并行測序。

  CRISPR基因編輯

  如何出現(xiàn)?

  在細(xì)菌的基因末端，一段 DNA序列會緊接著一段它自己的反向序列，然后再接一段大約30bp左右的、貌似是由堿基隨機(jī)排列而成的DNA序列，科學(xué)家們曾稱之為“空格DNA(spacer DNA)”，由于在大約40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌(archaea)中都能夠觀察到這種現(xiàn)象，于是科學(xué)家們給這種序列取了一個名字——成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，簡而言之CRISPR。如今，CRISPR熱度已趕超上世紀(jì)末開始大放光彩的簡稱PCR的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)。

  如何工作?

  CRISPR/Cas9技術(shù)的產(chǎn)生與DNA測序技術(shù)的進(jìn)步密不可分。CRISPR由兩部分組成：一部分是可以切割基因的“手術(shù)刀”蛋白Cas9;另一部分是拖著“手術(shù)刀”在基因組的“茫茫大海”中精確定位的向?qū)NA(Guide RNA)。一些科學(xué)家用滅活版本的Cas9蛋白與向?qū)NA結(jié)合，改造出只有精確定位功能的CRISPR技術(shù)，可用來關(guān)閉或打開幾乎任何單個基因，或者精細(xì)地調(diào)控它們的活躍程度，這被視為令人激動的一個研究方向。

  如何改變生物醫(yī)學(xué)進(jìn)程?

  幾千年來，人類一直在改造大自然?，F(xiàn)在，有了被譽為“基因剪刀”的CRISPR基因組編輯技術(shù)，人類有望以前所未有的能力改造自身。CRISPR技術(shù)問世僅3年，就已被全世界生物醫(yī)學(xué)實驗室和制藥企業(yè)廣泛應(yīng)用。

  首先，通過CRISPR方法構(gòu)建一種小鼠動物病理模型僅需數(shù)周，遠(yuǎn)低于過去的近1年時間，并能以更快的速度對基因進(jìn)行研究，同時可以一次對細(xì)胞內(nèi)的多個基因進(jìn)行遺傳學(xué)改造，研究這些基因之間的相互作用;其次，通過CRISPR技術(shù)成功打造“基因驅(qū)動”系統(tǒng)，并被用于根除瘧疾、登革熱等蟲媒疾病、消滅或控制入侵物種等;第三，哈佛大學(xué)研究人員利用CRISPR技術(shù)一次性敲除豬細(xì)胞中62個逆轉(zhuǎn)錄病毒基因，從而掃清豬器官用于人體移植的重大難關(guān)，給異種器官移植工作帶來了曙光，為全世界需要器官移植的上百萬病人帶來希望;第四，中山大學(xué)黃軍就利用CRISPR技術(shù)成功修改人類胚胎基因，或可用于治療地中海貧血等疾病。

  科學(xué)家們夢想能操縱基因，CRISPR如今讓它成為現(xiàn)實，它的能力令人極其興奮?？蒲腥藛T相信，在CRISPR的推動下，一場生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的革命正在到來。無論好壞，我們正翱翔在CRISPR的世界里。

 單細(xì)胞測序是一個新興的領(lǐng)域

  如何出現(xiàn)?

  細(xì)胞是生物學(xué)的基本單位，人體大約由200種不同類型近40兆(trillion)個細(xì)胞組成。在這種顯著的多樣性中，科學(xué)家們通常都是在大批量地探索細(xì)胞，曾發(fā)現(xiàn)了一種對成千上萬個細(xì)胞一次分析的辦法，不過這反映的是人體的整個細(xì)胞，而不是單個特定細(xì)胞狀況。出現(xiàn)這種狀況的原因是從單個細(xì)胞中提取的DNA(RNA/蛋白)不足以進(jìn)行基因組規(guī)模的研究。

  捕獲單個細(xì)胞和泡沫分離的液體，并準(zhǔn)備進(jìn)行分析

  單細(xì)胞測序指DNA研究中涉及測序單細(xì)胞微生物相對簡單的基因組，更大更復(fù)雜的人類細(xì)胞基因組，是在單細(xì)胞水平對全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的一項新技術(shù)。盡管早在1990年，Norman Iscove的課題組就通過PCR技術(shù)實現(xiàn)了對cDNA分子的指數(shù)級擴(kuò)增，證實對單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析是可行的 ;但單細(xì)胞測序萌芽于2010年，2013年左右才真正發(fā)展起來;2014年，單細(xì)胞測序的應(yīng)用被列為Nature Methods年度最重要的方法學(xué)進(jìn)展;2015基因組學(xué)前沿研討會將單細(xì)胞組學(xué)單獨列為一個單元。

  如何工作?

 單細(xì)胞測序的工作流

  單細(xì)胞測序分為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和單細(xì)胞基因組測序。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分為：單細(xì)胞DGE、單細(xì)胞polyA測序、單細(xì)胞lncRNA測序;單細(xì)胞基因組測序分為：單細(xì)胞外顯子組測序和單細(xì)胞全基因組重測序。

  單細(xì)胞測序技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用主要包括癌癥領(lǐng)域和生殖領(lǐng)域的應(yīng)用。譬如華大基因用解析單細(xì)胞基因組研究原發(fā)性血小板增多癥(一種血癌)和腎透明細(xì)胞癌(一種腎癌)的腫瘤內(nèi)部遺傳特征;MD安德森癌癥中心的遺傳學(xué)家通過單細(xì)胞分辨率乳腺癌遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)單個細(xì)胞通常包含數(shù)十個罕見突變，而這些突變采用大型腫瘤測序方法通常無法檢測到;Smart-Seq的基因組測序方法可以深入分析臨床相關(guān)的單細(xì)胞;謝曉亮團(tuán)隊通過MALBAC進(jìn)行單基因遺傳病和染色體異常同時篩查助力孕婦誕生了試管嬰兒。

  總之，利用單細(xì)胞基因組學(xué)，研究人員可以逆向操控發(fā)育過程，揭示出了單個的前體細(xì)胞類型是如何生成這兩種不同的成熟肺泡細(xì)胞的。在個別細(xì)胞之間的遺傳差異表達(dá)方面擁有無與倫比的優(yōu)勢，為癌癥發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及其診斷、治療提供了新的研究思路并開辟了新的研究方向。杰克遜實驗室單細(xì)胞基因組學(xué)研究室主任Paul Robson在一份聲明中表示，目前單細(xì)胞基因組學(xué)技術(shù)正在快速發(fā)展，而增加專門從事研究領(lǐng)域的實驗室或?qū)楦嗟纳飳W(xué)家提供最好的可用工具來進(jìn)行基因組學(xué)研究;單細(xì)胞基因組學(xué)研究中心的成立或?qū)楦嗟穆?lián)合研究提供更多機(jī)會。