“閃耀”Nature 拉曼顯微術(shù)突破傳統(tǒng)光學(xué)成像顏色極限

  近年來(lái)，顯微鏡技術(shù)在不斷地突破自身的局限來(lái)自美國(guó)哥倫比亞大學(xué)的研究人員報(bào)道了一種全新的成像技術(shù)：電子預(yù)共振受激拉曼散射顯微鏡(Electronic Pre-Resonance Stimulated Raman Scattering Microscopy)。
   這一技術(shù)結(jié)合了拉曼散射光譜窄(～1 nm)以及熒光分析靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。研究人員利用這種熒光成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了24種顏色各異的探針，展示了多達(dá)16種顏色的活細(xì)胞成像和8種顏色的腦組織成像。
   這一研究成果公布在4月19日的Nature雜志上，文章的通訊作者是哥倫比亞大學(xué)化學(xué)系閔瑋教授，閔瑋早年畢業(yè)于北京大學(xué)，2008年在哈佛大學(xué)獲化學(xué)博士學(xué)位，導(dǎo)師為美國(guó)科學(xué)院院士謝曉亮教授，之后在其課題組從事博士后研究。閔瑋博士現(xiàn)任哥倫比亞大學(xué)化學(xué)系終身教授，研究成果多次發(fā)表在Nature Method、PNAS等國(guó)際學(xué)術(shù)期刊，因其科學(xué)貢獻(xiàn)獲得過(guò)很多獎(jiǎng)項(xiàng)，其中包括2013年的斯隆研究獎(jiǎng)。
   近年來(lái)，顯微鏡技術(shù)在不斷地突破自身的局限。2000年以來(lái)興起的超分辨熒光成像技術(shù)，已經(jīng)突破了光學(xué)衍射極限。2015年，閔瑋研究組開發(fā)出一種新的方法，即基于受激拉曼散射(SRS)成像，可視化單細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖攝取活性，并展示了其在肝癌細(xì)胞、腫瘤異種移植組織、原代神經(jīng)元及小鼠腦組織中的應(yīng)用。這是亞細(xì)胞分辨率的一個(gè)突破。
 　　電子預(yù)共振受激拉曼散射是拉曼散射的一種特殊形式。拉曼散射信號(hào)通常很微弱，受激拉曼散射通過(guò)兩束滿足共振條件泵浦和斯托克斯激光與分子特定振動(dòng)發(fā)生特異性耦合來(lái)增強(qiáng)信號(hào)。受激拉曼散射和生物成像的結(jié)合是由哈佛大學(xué)謝曉亮教授首次在Science雜志報(bào)導(dǎo)，閔瑋博士就是其中的主要發(fā)明人，謝曉亮教授曾表示，他想在無(wú)熒光標(biāo)記的情況下增加拉曼光譜的靈敏度，甚至來(lái)檢測(cè)單分子。但是這個(gè)項(xiàng)目實(shí)在太難了，謝曉亮幾乎無(wú)法說(shuō)服學(xué)生們來(lái)嘗試，最終是閔瑋接受了挑戰(zhàn)，他與一位德國(guó)的研究生Chris Freudiger取得了突破：通過(guò)探測(cè)受激拉曼散射信號(hào)獲得了無(wú)需熒光標(biāo)記的生物醫(yī)學(xué)顯微圖像。
  自此之后，這一技術(shù)被廣泛應(yīng)用在生命分析研究中。電子共振拉曼散射則是另一種增強(qiáng)拉曼信號(hào)的方法：當(dāng)泵浦激光的頻率接近分子的電子能級(jí)躍遷頻率(即吸收波長(zhǎng))時(shí)，與電子能級(jí)躍遷耦合相關(guān)的分子振動(dòng)光譜也被選擇性增強(qiáng)。因此，將電子共振拉曼散射和受激拉曼散射結(jié)合，可以極大地提升拉曼信號(hào)。
  然而當(dāng)泵浦激光頻率嚴(yán)格等于分子的電子能級(jí)躍遷頻率時(shí)，分子不但會(huì)經(jīng)歷電子共振受激拉曼散射，同時(shí)也有其他的泵浦-探測(cè)過(guò)程干擾檢測(cè)信號(hào)。在這篇文章中，研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)泵浦激光頻率略低于分子的電子能級(jí)躍遷頻率(實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與分子吸收峰相差2100波數(shù)左右)時(shí)，可以在實(shí)現(xiàn)最大的信號(hào)增強(qiáng)的同時(shí)，避免檢測(cè)背景的干擾。
  這項(xiàng)技術(shù)就是電子預(yù)共振受激拉曼散射，可以將以前普遍使用的無(wú)共振的受激拉曼散射信號(hào)提升1000倍左右，1毫秒內(nèi)的對(duì)應(yīng)檢出限在250 nM，從而可以勝任大部分生物分子的成像分析。
  之后這一研究組著力于尋找和開發(fā)合適的分子探針。由于選用的泵浦激光器波長(zhǎng)在900 nm左右，其對(duì)應(yīng)的預(yù)共振拉曼探針吸收波長(zhǎng)在650-750 nm時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)最佳的信號(hào)提升。這個(gè)波長(zhǎng)段的商用分子探針，如Alexa647、Atto740等，都在C=C碳碳雙鍵區(qū)間顯示了特征的預(yù)共振拉曼譜。
  研究人員利用5種商用分子探針的預(yù)共振拉曼散射并結(jié)合3種熒光探針，實(shí)現(xiàn)了8種顏色的活細(xì)胞成像。為了進(jìn)一步克服碳碳雙鍵區(qū)間波段非常擁擠的缺點(diǎn)，他們創(chuàng)新地發(fā)明和發(fā)展了一系列含有炔基(碳碳三鍵)和氰基(碳氮三鍵)的分子探針。由于炔基和氰基的拉曼振動(dòng)在無(wú)干擾的2000-2300 cm-1區(qū)間有單一的特征頻率，且與生物體內(nèi)常見(jiàn)基團(tuán)有顯著區(qū)別，該區(qū)間的拉曼探針可以比在擁擠的“指紋區(qū)”實(shí)現(xiàn)更多的“顏色”。研究人員結(jié)合了同位素標(biāo)記和結(jié)構(gòu)修飾等策略，合成了28種吸收在650-750 nm、三鍵振動(dòng)頻率在2000-2300 cm-1的新型預(yù)共振拉曼探針，并為他們?nèi)∶麨镸anhattan Raman Scattering(MARS)調(diào)色板。
  研究人員還通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞和大腦切片的成像，展示了預(yù)共振受激拉曼散射顯微鏡及其相應(yīng)探針技術(shù)在生命科學(xué)研究中的潛力。
  他們對(duì)小鼠海馬體神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了體外培養(yǎng)，并用免疫標(biāo)記的方法標(biāo)記了5種不同的標(biāo)志蛋白，用兩種正交的代謝標(biāo)記對(duì)細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行脈沖-追蹤實(shí)驗(yàn)，并用DNA染料確定細(xì)胞核的位置。通過(guò)對(duì)8種“顏色”的細(xì)胞圖像進(jìn)行交叉對(duì)比分析，研究人員觀察到新生成的包涵體主要是由新合成的蛋白質(zhì)構(gòu)成。而星形膠質(zhì)細(xì)胞中的內(nèi)涵體遠(yuǎn)多于神經(jīng)元細(xì)胞。他們認(rèn)為這個(gè)實(shí)驗(yàn)支持了一個(gè)假說(shuō)：星形膠質(zhì)細(xì)胞可以將新合成的折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)隔離進(jìn)入包涵體來(lái)減弱他們的毒性，然而神經(jīng)元細(xì)胞沒(méi)有這種能力，因此對(duì)蛋白質(zhì)調(diào)控的錯(cuò)亂更加沒(méi)有耐受性。
   除此之外，閔瑋研究組還開發(fā)了一種通用方法，可成像如小分子藥物和核酸、氨基酸、脂類等廣譜生物小分子，確定它們的定位以及在細(xì)胞內(nèi)的功能機(jī)制。
  當(dāng)涉及到生物小分子時(shí)，熒光標(biāo)記則存在問(wèn)題，因?yàn)闊晒鈭F(tuán)幾乎總是大于目的小分子或是與目的小分子差不多大小。因此，它們往往會(huì)破壞這些發(fā)揮重要生物作用的小分子的正常功能。閔瑋研究組放棄常規(guī)的熒光團(tuán)熒光成像范式，轉(zhuǎn)而追尋一種新型的物理和化學(xué)組合。具體說(shuō)來(lái)，他們將一種稱作為受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering, SRS)顯微鏡的新興激光技術(shù)，與一種小型但非常有活力的炔烴標(biāo)記(即C≡C，碳碳三鍵)相結(jié)合，C = C是一種化合物鍵，當(dāng)其拉伸時(shí)，會(huì)以獨(dú)特的“頻率”(不同于細(xì)胞內(nèi)的自然分子)發(fā)出強(qiáng)烈的拉曼散射信號(hào)。
  采用這一小型的炔烴標(biāo)記，這一新技術(shù)避免了采用更大熒光標(biāo)記物造成的干擾，同時(shí)通過(guò)SRS成像獲得了高檢測(cè)特異性和靈敏度。通過(guò)將激光顏色調(diào)整至炔烴頻率，并快速用聚焦激光光束逐點(diǎn)掃過(guò)樣本，SRS顯微鏡可捕獲小分子攜帶的C≡C鍵的獨(dú)特拉伸運(yùn)動(dòng)，生成活細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)分子的三維圖像。以這種方式，閔瑋研究小組證實(shí)可以追蹤小鼠組織中帶有炔烴的藥物，以及顯影通過(guò)在活細(xì)胞中代謝納入炔烴標(biāo)記的前體小分子重新合成的DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷脂和甘油三酯。
  編輯點(diǎn)評(píng)
  研究人員結(jié)合了同位素標(biāo)記和結(jié)構(gòu)修飾等策略，合成了新型預(yù)共振拉曼探針，此外，研究人員通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞和大腦切片的成像，展示了預(yù)共振受激拉曼散射顯微鏡及其相應(yīng)探針技術(shù)在生命科學(xué)研究中的潛力。重大發(fā)現(xiàn)與研究將受益生物探索。