ACE反相系統(tǒng)性方法開發(fā)方案

使用ACE方法開發(fā)工具包(MDKs)進行色譜柱篩選

方法開發(fā)的四個簡化步驟
• ACE MDKs包括了為互補選擇性而精心設(shè)計的3支色譜柱。
• 色譜柱篩選是一種簡單而又功能強大的方法, 可以快速識別最合適的色譜柱。
• 通過篩選2種不同的流動相有機改性劑可以使方法更全面。
• 以下的流程圖總結(jié)了如何通過4個簡單步驟執(zhí)行方法開發(fā)篩選。

開始

第一步：選擇流動相pH和緩沖液
根據(jù)分析物性質(zhì) (即pKa, logP和logD數(shù)據(jù)) 進行選擇。對于未知分析物，使用酸性流動相作為起點。

第二步：使用ACE 方法包 (3或6支色譜柱)
梯度掃描以MeOH和MeCN作為有機溶劑,進行5-95％梯度篩選。

第三步：查看數(shù)據(jù)

選擇蕞佳色譜柱和有機改性劑。

第四步：方法優(yōu)化

如有必要, 檢查溫度, pH值, 梯度斜率,梯度范圍等。

是否實現(xiàn)分離？

是-方法開發(fā)完成

否-改變流動相條件（pH值,緩沖液等），回到第二步繼續(xù)實驗。

選擇色譜柱和粒徑尺寸。
由LC系統(tǒng)和用戶的偏好決定。對于400 bar的HPLC系統(tǒng)來說, 5μm 150 x 4.6mm是個不錯的選擇。
對于600 bar優(yōu)化的HPLC系統(tǒng), 可使用2 和3μm粒徑的較短色譜柱 (如100mm)。1.7μm粒徑的短柱 (如50mm)適用于UHPLC系統(tǒng)。

如何確定合適的篩選梯度時間？
梯度時間可以使用公式1計算。
VM可用公式2計算。

tG = 梯度時間 (mins.) k* = 梯度保留系數(shù) (通常設(shè)置約為5) ΔΦ = 梯度范圍 (即對于5-95％B梯度，ΔΦ= 0.9) VM = 柱內(nèi)體積 (mL) S = 5 對于小分子 (＜1000沓) F = 流速 (mL/min) L = 色譜柱長度 (mm) dc = 柱內(nèi)徑 (mm）

請務(wù)必記住在下一次注射前, 在梯度洗脫后以至少10倍V_M (柱內(nèi)體積) 進行一次等度重新平衡。

為何使用色譜柱篩選？

• 改變色譜柱的固定相可能對選擇性造成顯著影響 (圖1)。
• 在相同的流動相條件下, 篩選不同的色譜柱可以幫助您以更高的分辨率更快地實現(xiàn)所需的分離。

圖1：改變色譜柱固定相的影響。
色譜柱：50x2.1mm

流動相：A = 0.1％甲酸的水溶液，B = 含0.1%甲酸的甲醇:水(9:1 v/v)

梯度：5分鐘內(nèi)3-100%B，
流速：0.06mL/min

溫度：40°C

檢測：UV，254nm

樣品：1）甲硝唑，2）芐醇，3）氫氯噻嗪，4）香草醛，5）羥苯甲酯，6）1,2-二硝基苯

• ACE MDKs將具有不同相互作用機制的色譜柱組合在一起, 以最大限度地提高選擇性并增加分離具有挑戰(zhàn)性的混合物的可能性。
• 性價比高, ACE MDKs與單支色譜柱價格相同！
• 兩種蕞受歡迎的ACE反相 (RP) MDK (參見下表) 包括了為利用不同的保留機制和最大化選擇性而獨特設(shè)計的相。
• 所有六個相都可以在反相 (RP) 條件下使用, 并且具有與C18一樣的穩(wěn)定性。

¹近似值– 通過半定量機制加權(quán)和/或通過參考使用>100特征分析物的其他ACE相來確定。

• 其他的ACE方法包還有HILIC分析包, 生物大分子300Å分析包和實心核(UltraCore) 分析包
• 同樣提供微孔柱尺寸 (內(nèi)徑0.5和1.0mm)。

成功范例
對乙酰氨基酚及有關(guān)物質(zhì)