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Vivaflow® 200:用于雜交瘤上清液濃縮的關鍵性樣本制備工具

作者: 2018年07月17日 來源:全球化工設備網(wǎng) 瀏覽量:
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摘要本研究的重點是在進行親和色譜前使用Vivaflow®200切向流膜包對多達3L的鼠雜交瘤澄清上清液進行10倍濃縮。研究發(fā)現(xiàn),同時使用兩塊Vivaflow®200(截留分子量(MWCO)30kDa)時,抗體回收率始終超過98%,濃縮速

 

摘要

本研究的重點是在進行親和色譜前使用Vivaflow® 200切向流膜包對多達3 L的鼠雜交瘤澄清上清液進行10倍濃縮。研究發(fā)現(xiàn),同時使用兩塊Vivaflow® 200 (截留分子量 (MWCO) 30 kDa) 時,抗體回收率始終超過98%,濃縮速度約為20 – 25 mL/分。

 

簡介

采用雜交瘤技術生產(chǎn)的單克隆抗體在 (生物制藥行業(yè)、研究以及體外診斷 (IVD) 產(chǎn)品的生產(chǎn)中均有廣泛應用。諸如蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光和ELISA等分析技術應用廣泛。生產(chǎn)和加工單克隆抗體——特別是為IVD市場用戶生產(chǎn)需要一些保證優(yōu)質(zhì)的措施,如實施ISO 9001質(zhì)量體系以及采用zui新的技術。

 

抗體生產(chǎn)中一個不可缺少的步驟就是使用超濾和微濾膜進行過濾 (1, 2)。攪拌加壓過濾曾是zui常用的實驗室濃縮方法,濃縮體積不到500 mL。以往的常見問題包括速度慢、泡沫過多以及缺少死體積保留導致抗體大量丟失。這迫使生產(chǎn)科學家尋找實驗室規(guī)模的正切流動過濾 (TFF) 方法。

 

使用微濾或超濾膜進行TFF廣泛用于蛋白和抗體的澄清、濃縮或緩沖液更換 (3, 4)。原料橫向流過濾膜 (正切)。在超濾模式下,低分子量分子通過濾膜濾出到濾液,而包含目標抗體的原料則可在很短的時間里不斷濃縮到相對較高的蛋白濃度。

 

1Vivaflow® 200正切流動膜包 (A) 及樣本容器 (B)、蠕動泵 (C) 和濾液收集瓶 (D)

 

穩(wěn)定、可靠、可重復的樣本制備 (如蛋白和抗體濃縮/緩沖液更換是所有生物試劑下游加工過程的基礎步驟。在BioservUK,Vivaflow® 200循環(huán)流道膜包一直是shou選的濃縮工具,用于蛋白A或蛋白G制備色譜前雜交瘤澄清上清液原料的濃縮,最大體積可達3 L。選擇超濾濃縮器時應考慮以下參數(shù):超濾膜的質(zhì)量、濃縮速度、抗體回收率、可重復使用性和成本效益。

 

在本文中,我們介紹了在BioservUK使用切向流動工藝對不同鼠IgG單克隆抗體亞類進行濃縮的情況。

 

材料和方法

2:在BioservUK3 L雜交瘤原料進行下游加工的工作流程。

 

上清液來自雜交瘤細胞,后者由鼠B淋巴細胞和Sp2.0小鼠骨髓瘤細胞系融合而成,并進行轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。雜交瘤細胞常規(guī)培養(yǎng)在添加了歐盟批準的10%胎牛血清 (Gibco貨號:10270-106) RPMI 1640培養(yǎng)基 (Gibco貨號:21875) 中。將一種原料在48°C下以8,000 g的離心力離心10分鐘,進行澄清。用2 L水預先清洗VF200,以去除儲存緩沖液。預先清洗過程中檢查Vivaflow® 200的完整性,時間在1分鐘以上,確保濾液流速> 55 mL/分鐘。

 

然后用兩個并行連接的Vivaflow® 200 (30 kDa MWCOPES,Sartorius貨號:VF20P2) 15號泵頭將上清液濃縮10 (1)。細胞培養(yǎng)液中抗體濃度通常約為30 mg/L。經(jīng)過Vivaflow® 200處理后抗體濃度一般約為300 mg/L (10倍濃縮)。

 

Vivaflow® 200濃縮器最大流速以3個大氣壓限值指示。抗體濃縮后,將膜包用2 L水清洗,然后在再循環(huán)模式下用500 ml 0.5 M NaOH1%次氯酸鈉溶液原位清洗 (CiP) 40分鐘。隨后用2 L水沖洗膜包,最后加入200 ml 20%乙醇,在2– 8°C下儲存。將300 mL濃縮液在3,500 g下離心10分鐘,進一步去除顆粒物,然后用500 ml Sartolab RF真空濾器 (Sartorius貨號:180C2-E) 進行0.22 μm過濾,之后進行蛋白G HiFliQ 5 mL柱純化 (蛋白Ark貨號:HiFlIQ5-PG-5)

 

 

結(jié)果

我們所有1– 3 L樣本濃縮步驟的標準操作規(guī)程 (SOP) 中均包含Vivaflow® 200。該儀器使用極其簡便,濃縮速度約為20 – 25 mL/分時抗體回收率始終> 98%。重要的是,不可回收的滯留體積不到1 ml,十分理想,即使清洗步驟中壓力指示燈亮起也不影響回收率。整套獨立式系統(tǒng)可方便地與Masterflex Easy-Load蠕動泵頭連接和斷開,能夠儲存在冰箱中,隨時重復使用,無需手動調(diào)節(jié)。該系統(tǒng)無需手工操作,干凈清爽。

 

我們每20分鐘監(jiān)測一次流速,方法是在蠕動泵恒定速度下測定濾液體積。相應的Masterflex L/S Economy Drive蠕動泵設置為3。圖4顯示了通常的流速,在20–25 mL/分范圍內(nèi)。將3 L樣本濃縮10倍一般需要2小時。

 

BioservUK,我們建立了Vivaflow® 系統(tǒng),適用于不同的免疫球蛋白G (IgG) 亞類。所有鼠IgG亞類 (IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3) 的回收率均超過98%。每完成3L樣本制備就進行一次原位清洗。各個Vivaflow® 200膜包僅用于一種特定的IgG亞類。我們的SOP允許每個膜包的最大產(chǎn)量為50 L。

 

結(jié)論

Vivaflow® 200正切流動膜包使用簡便、流速快、成本低、通量高,且具有廣泛的化學相容性和總體耐用性,因此,我們圍繞該過濾濃縮步驟進行了1– 3 L雜交瘤培養(yǎng)液的下游加工。而在攪拌加壓過濾裝置中,使用的水平薄膜盤導致免疫球蛋白G在膜表面結(jié)塊,從而使得流速顯著降低,IgG損失可達40%。

 

我們得出的結(jié)論是,Vivaflow® 200是一款獨特的實驗室規(guī)模TFF耗材,研究表明這些橫向流動膜包是一種不可或缺的工具,適用于各種亞類的單克隆IgG的濃縮。對于體積高達3 L的樣本而言,Vivaflow® 200仍是我們的shou選,它是一款單克隆抗體級的超濾濃縮器。

 

 

參考文獻
1. Kemken R et al (1997) Dynamic membrane filtration in
mammalian cell culture harvest. In: Carrondo MJT, Griffiths B,
Moreira JLP (eds) Animal Cell Technology. Springer, Dordrecht.
2. Bertera R, Steven H, Metcalfe M (1984) Development Studies
of crossflow filtration, The Chemical Engineer. 401: 10.
3. Velez D, Miller L, MacMillan JD (1989) Use of tangential
flow filtration in perfusion propagation of hybridoma cells
for production of monoclonal antibodies. Biotech & Bioeng,
33 (7): 938.
4. Van Reis R et al (1997) high performance tangential flow
filtration. Biotech & Bioeng, 56 (1): 71.


免責聲明
實驗和方法均已獨立完成,作者對本文全部內(nèi)容負責。

 

 

 

 

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