瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀是為有效制備生物樣品而設(shè)計的，用于PCR引物、探針和組分生產(chǎn)，DNA測序、DNA和RNA合成、隨機啟動、載體設(shè)計、DNA指紋和人工基因合成。是DNA/RNA/寡核苷酸脫保護基快捷高效穩(wěn)定的解決方案。反應(yīng)可直接在96位樣品架上進行，如“深井”板。6-10個樣品架可用于10升壓力反應(yīng)器。因此，操作工作量大大縮短。樣品被填充不同的板，例如帶有過濾底座、特殊蓋等，通過設(shè)計的電動升降系統(tǒng)，在反應(yīng)中和反應(yīng)后自動移出壓力容器進行干燥。在開啟和關(guān)閉過程中，會抽走腐蝕性反應(yīng)氣體，確保實驗室人員的完全安全。與樣品的反應(yīng)發(fā)生在氣相的壓力和微波效應(yīng)下。高氣相濃度會在幾分鐘內(nèi)引起完全均勻的反應(yīng)。在系統(tǒng)中，所有操作參數(shù)均一直根據(jù)程序條件進行控制，并以圖形方式記錄和存儲以進行質(zhì)量控制。在整個過程中，液體試劑以及氣相中的壓力和溫度是被控制的。這確保了樣品的完整、可重復(fù)和均勻反應(yīng)，以便隨后分離出選擇性DNA序列。獨特的10升反應(yīng)器容量為極高的樣品吞吐量提供了新的可能性。

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀應(yīng)用：

食品工業(yè)

研究機構(gòu)

大學(xué)

分子生物學(xué)

遺傳學(xué)

合成生物學(xué)

醫(yī)學(xué)

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀特點：

反應(yīng)器容量：10升容量

樣品數(shù)量：6至10個，每個樣品有96位。

溫度范圍:*200°C

功率輸出：1200瓦

符合CE標志

保修12個月

電源：220 V至240 V/50/60 Hz

*功耗：2500瓦

顯示屏：彩色觸摸屏

尺寸:W x D x H 52 x 73 x 123厘米（無終端）

重量：180公斤

DNA化學(xué)合成固有的錯誤率較高，片段越長越是如此，挑選序列正確的克隆所花費的時間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實花費了無數(shù)學(xué)生們的不少好時光。所以，大家的選擇標準也從價格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過去拼價格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。

說起DNA合成，幾位前輩師兄師姐們猶會提起上世紀90年代世行dai款買儀器，好些單位甚至醫(yī)院都趕時髦買了DNA合成儀，買回來才發(fā)現(xiàn)自己那點合成需求和費用，委實買得起用不起，那昂貴的設(shè)備成了擺設(shè)。彼時國外DNA合成雖然質(zhì)量好純度高，可寄回來海關(guān)不好過，時間上實在傷不起，幸虧國內(nèi)迅速崛起的幾家DNA定制合成供應(yīng)商，以到貨速度快和價格優(yōu)勢漸漸占據(jù)了低端市場，對于實驗室來說，DNA定制合成于是變成了發(fā)傳真+等收貨那么簡單的事。

也沒那么簡單。DNA化學(xué)合成固有的錯誤率較高，片段越長越是如此，挑選序列正確的克隆所花費的時間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實花費了無數(shù)學(xué)生們的不少好時光。所以，大家的選擇標準也從價格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過去拼價格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。不純化，PAGE純化，HPLC純化，到反相純化，有多大區(qū)別？純化過的DNA oligo是不就去除了全部錯誤序列呢？我們得先從DNA合成的錯誤成因談起：

1. 內(nèi)部缺失（n-1，n-2 etc）產(chǎn)物。這是化學(xué)合成DNA zui普遍與zui主要的限制因素，且不能通過純化DNA oligo來解決這個問題?；瘜W(xué)合成DNA不及活細胞內(nèi)DNA復(fù)制具有高保真性，在活細胞內(nèi)，存在大量的校正與修復(fù)系統(tǒng)，將堿基突變率降低至1/(1×106)以下。PCR反應(yīng)也具有較高的保真度，例如：錯誤率在1/1000——1/10000，并且還可通過DNA 聚合酶的性能提高保真度。但是化學(xué)合成DNA不同，每單個合成循環(huán)的錯誤率約為1/100，隨堿基數(shù)目增加而增加。其原因包括：

(1)DNA oligo的化學(xué)合成是堿基與堿基之間通過化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)而成，而化學(xué)反應(yīng)的偶聯(lián)效率一般在99%左右，也就是說，在每次進行偶聯(lián)反應(yīng)時，都會有1%的DNA片段附加不上新的堿基，對這種截斷的失敗序列，為了防止其參與后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)，采用CapA與CapB進行化學(xué)封閉，以阻斷其延伸，但化學(xué)封閉反應(yīng)的效率不可能達到100%。導(dǎo)致出現(xiàn)合成失敗的DNA片段或截斷序列殘留在合成的DNA粗制品中。

(2)DNA oligo的不完全脫保護。寡核苷酸的完全脫保護包括從磷酸酯基團、堿基上的環(huán)外氨基和5′-OH部分上去掉保護基團。脫保護的化學(xué)反應(yīng)效率不可能達到100%，未脫保護的堿基無法參加偶聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致DNA oligo內(nèi)部缺失堿基。

(3)不斷延長的DNA鏈與不斷累積的副產(chǎn)物會干擾DNA oligo的化學(xué)合成。

對于以上三方面問題，至今為止還沒有找到一個完美的解決方案。因為延長蓋帽時間也不能保證封閉反應(yīng)效率達到100%；而對于脫保護反應(yīng)來說，增加脫保護試劑量及延長脫保護時間又會導(dǎo)致DNA oligo脫嘌呤。因此只能采取折衷方法將不完全脫保護與脫嘌呤同時控制在低水平上。內(nèi)部缺失堿基的截斷序列絕不可能100%去除干凈，對于幾種純化方法來說，OPC或HPLC不可能去除內(nèi)部缺失堿基的截斷序列，zui好的方法是通過PAGE純化降低截斷序列數(shù)量。

2.　單核苷酸的插入是存在于目的DNA oligo產(chǎn)物中的另一種常見的序列錯誤。

當(dāng)同一DNA oligo分子中存在G-偶聯(lián)或單堿基插入(n+1)同時又存在單堿基缺失（n-1）時，此條DNA oligo的長度與目的DNA分子的長度相同，因此無法通過OPC 、HPLC或PAGE純化將此“失敗序列”去除。 DNA oligo化學(xué)合成存在的這些弊端曾被Hecker KH與Rill R報道過（Error analysis of chemically synthesized polynucleotides.　Biotechniques，1998 Feb；24：256-260）。在這篇文章中，作者合成并PAGE純化了長鏈DNA oligo，用它們進行PCR克隆，然后測序鑒定了10個克隆，發(fā)現(xiàn)存在7個單堿基缺失，一個連續(xù)的4個堿基缺失，一個G-C替換。除了這些堿基錯誤，其它學(xué)者還曾報道存在G-偶聯(lián)、分支及其n+x產(chǎn)物。

為了解決上述堿基出錯的問題，首先要優(yōu)化化學(xué)合成方法來提高DNA oligo的純度，并且對DNA oligo粗制品進行純化，雖然無論哪種純化方式都不能保證百分之百去除錯誤序列，但能改善產(chǎn)品的純度，進而提高實驗的成功率。Oligo的純化方式最常見的有脫鹽、OPC、PAGE和HPLC。脫鹽只能去除氨、鹽等雜質(zhì)，而不能有效去除合成過程中產(chǎn)生的短片段，因此一般只能用于普通的PCR反應(yīng)和測序。HPLC和PAGE純化得到的純度很高，但只能進行手工操作，相當(dāng)費時費力。OPC不僅能去除短片段，當(dāng)DNA oligo的長度在40 bases以內(nèi)，其純度與HPLC或PAGE純化的純度相當(dāng)，而且由于簡便、快捷，能進行高通量（high-throughput）和自動化（automation）操作，因而受到很多DNA合成公司的青睞。

但OPC純化也有一個缺點，就是在操作過程中需要一種弱酸脫掉DMT基團，而DNA Oligo在酸性條件下容易脫嘌呤（depurination）。對于脫嘌呤后的堿基，DNA聚合酶不能識別，可能導(dǎo)致PCR擴增后出現(xiàn)堿基缺失或錯配。因此，有些公司不推薦OPC純化用于克隆、突變、基因合成等實驗。

一般來說，不同廠家的合成方法其實并沒有什么大的本質(zhì)的區(qū)別，只是有一些經(jīng)驗的積累和技巧。比如脫保護劑濃度的選擇很重要，太低脫保護不完全，太高又增加脫嘌呤的機率，還有如何優(yōu)化程序，使蓋帽更充分、更完全等等…。純化方式的選擇，一般說來修飾標記要用HPLC純化，長鏈要用PAGE 純化，但這兩種純化方式都非常費時耗力。

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀是為有效制備生物樣品而設(shè)計的，用于PCR引物、探針和組分生產(chǎn)，DNA測序、DNA和RNA合成、隨機啟動、載體設(shè)計、DNA指紋和人工基因合成。是DNA/RNA/寡核苷酸脫保護基快捷高效穩(wěn)定的解決方案。反應(yīng)可直接在96位樣品架上進行，如“深井”板。6-10個樣品架可用于10升壓力反應(yīng)器。因此，操作工作量大大縮短。樣品被填充不同的板，例如帶有過濾底座、特殊蓋等，通過設(shè)計的電動升降系統(tǒng)，在反應(yīng)中和反應(yīng)后自動移出壓力容器進行干燥。在開啟和關(guān)閉過程中，會抽走腐蝕性反應(yīng)氣體，確保實驗室人員的完全安全。與樣品的反應(yīng)發(fā)生在氣相的壓力和微波效應(yīng)下。高氣相濃度會在幾分鐘內(nèi)引起完全均勻的反應(yīng)。在系統(tǒng)中，所有操作參數(shù)均一直根據(jù)程序條件進行控制，并以圖形方式記錄和存儲以進行質(zhì)量控制。在整個過程中，液體試劑以及氣相中的壓力和溫度是被控制的。這確保了樣品的完整、可重復(fù)和均勻反應(yīng)，以便隨后分離出選擇性DNA序列。獨特的10升反應(yīng)器容量為極高的樣品吞吐量提供了新的可能性。

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀應(yīng)用：

食品工業(yè)

研究機構(gòu)

大學(xué)

分子生物學(xué)

遺傳學(xué)

合成生物學(xué)

醫(yī)學(xué)

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀特點：

反應(yīng)器容量：10升容量

樣品數(shù)量：6至10個，每個樣品有96位。

溫度范圍:*200°C

功率輸出：1200瓦

符合CE標志

保修12個月

電源：220 V至240 V/50/60 Hz

*功耗：2500瓦

顯示屏：彩色觸摸屏

尺寸:W x D x H 52 x 73 x 123厘米（無終端）

重量：180公斤

DNA化學(xué)合成固有的錯誤率較高，片段越長越是如此，挑選序列正確的克隆所花費的時間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實花費了無數(shù)學(xué)生們的不少好時光。所以，大家的選擇標準也從價格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過去拼價格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。

說起DNA合成，幾位前輩師兄師姐們猶會提起上世紀90年代世行dai款買儀器，好些單位甚至醫(yī)院都趕時髦買了DNA合成儀，買回來才發(fā)現(xiàn)自己那點合成需求和費用，委實買得起用不起，那昂貴的設(shè)備成了擺設(shè)。彼時國外DNA合成雖然質(zhì)量好純度高，可寄回來海關(guān)不好過，時間上實在傷不起，幸虧國內(nèi)迅速崛起的幾家DNA定制合成供應(yīng)商，以到貨速度快和價格優(yōu)勢漸漸占據(jù)了低端市場，對于實驗室來說，DNA定制合成于是變成了發(fā)傳真+等收貨那么簡單的事。

也沒那么簡單。DNA化學(xué)合成固有的錯誤率較高，片段越長越是如此，挑選序列正確的克隆所花費的時間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實花費了無數(shù)學(xué)生們的不少好時光。所以，大家的選擇標準也從價格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過去拼價格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。不純化，PAGE純化，HPLC純化，到反相純化，有多大區(qū)別？純化過的DNA oligo是不就去除了全部錯誤序列呢？我們得先從DNA合成的錯誤成因談起：

1. 內(nèi)部缺失（n-1，n-2 etc）產(chǎn)物。這是化學(xué)合成DNA zui普遍與zui主要的限制因素，且不能通過純化DNA oligo來解決這個問題?；瘜W(xué)合成DNA不及活細胞內(nèi)DNA復(fù)制具有高保真性，在活細胞內(nèi)，存在大量的校正與修復(fù)系統(tǒng)，將堿基突變率降低至1/(1×106)以下。PCR反應(yīng)也具有較高的保真度，例如：錯誤率在1/1000——1/10000，并且還可通過DNA 聚合酶的性能提高保真度。但是化學(xué)合成DNA不同，每單個合成循環(huán)的錯誤率約為1/100，隨堿基數(shù)目增加而增加。其原因包括：

(1)DNA oligo的化學(xué)合成是堿基與堿基之間通過化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)而成，而化學(xué)反應(yīng)的偶聯(lián)效率一般在99%左右，也就是說，在每次進行偶聯(lián)反應(yīng)時，都會有1%的DNA片段附加不上新的堿基，對這種截斷的失敗序列，為了防止其參與后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)，采用CapA與CapB進行化學(xué)封閉，以阻斷其延伸，但化學(xué)封閉反應(yīng)的效率不可能達到100%。導(dǎo)致出現(xiàn)合成失敗的DNA片段或截斷序列殘留在合成的DNA粗制品中。

(2)DNA oligo的不完全脫保護。寡核苷酸的完全脫保護包括從磷酸酯基團、堿基上的環(huán)外氨基和5′-OH部分上去掉保護基團。脫保護的化學(xué)反應(yīng)效率不可能達到100%，未脫保護的堿基無法參加偶聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致DNA oligo內(nèi)部缺失堿基。

(3)不斷延長的DNA鏈與不斷累積的副產(chǎn)物會干擾DNA oligo的化學(xué)合成。

對于以上三方面問題，至今為止還沒有找到一個完美的解決方案。因為延長蓋帽時間也不能保證封閉反應(yīng)效率達到100%；而對于脫保護反應(yīng)來說，增加脫保護試劑量及延長脫保護時間又會導(dǎo)致DNA oligo脫嘌呤。因此只能采取折衷方法將不完全脫保護與脫嘌呤同時控制在低水平上。內(nèi)部缺失堿基的截斷序列絕不可能100%去除干凈，對于幾種純化方法來說，OPC或HPLC不可能去除內(nèi)部缺失堿基的截斷序列，zui好的方法是通過PAGE純化降低截斷序列數(shù)量。

2.　單核苷酸的插入是存在于目的DNA oligo產(chǎn)物中的另一種常見的序列錯誤。

當(dāng)同一DNA oligo分子中存在G-偶聯(lián)或單堿基插入(n+1)同時又存在單堿基缺失（n-1）時，此條DNA oligo的長度與目的DNA分子的長度相同，因此無法通過OPC 、HPLC或PAGE純化將此“失敗序列”去除。 DNA oligo化學(xué)合成存在的這些弊端曾被Hecker KH與Rill R報道過（Error analysis of chemically synthesized polynucleotides.　Biotechniques，1998 Feb；24：256-260）。在這篇文章中，作者合成并PAGE純化了長鏈DNA oligo，用它們進行PCR克隆，然后測序鑒定了10個克隆，發(fā)現(xiàn)存在7個單堿基缺失，一個連續(xù)的4個堿基缺失，一個G-C替換。除了這些堿基錯誤，其它學(xué)者還曾報道存在G-偶聯(lián)、分支及其n+x產(chǎn)物。

為了解決上述堿基出錯的問題，首先要優(yōu)化化學(xué)合成方法來提高DNA oligo的純度，并且對DNA oligo粗制品進行純化，雖然無論哪種純化方式都不能保證百分之百去除錯誤序列，但能改善產(chǎn)品的純度，進而提高實驗的成功率。Oligo的純化方式最常見的有脫鹽、OPC、PAGE和HPLC。脫鹽只能去除氨、鹽等雜質(zhì)，而不能有效去除合成過程中產(chǎn)生的短片段，因此一般只能用于普通的PCR反應(yīng)和測序。HPLC和PAGE純化得到的純度很高，但只能進行手工操作，相當(dāng)費時費力。OPC不僅能去除短片段，當(dāng)DNA oligo的長度在40 bases以內(nèi)，其純度與HPLC或PAGE純化的純度相當(dāng)，而且由于簡便、快捷，能進行高通量（high-throughput）和自動化（automation）操作，因而受到很多DNA合成公司的青睞。

但OPC純化也有一個缺點，就是在操作過程中需要一種弱酸脫掉DMT基團，而DNA Oligo在酸性條件下容易脫嘌呤（depurination）。對于脫嘌呤后的堿基，DNA聚合酶不能識別，可能導(dǎo)致PCR擴增后出現(xiàn)堿基缺失或錯配。因此，有些公司不推薦OPC純化用于克隆、突變、基因合成等實驗。

一般來說，不同廠家的合成方法其實并沒有什么大的本質(zhì)的區(qū)別，只是有一些經(jīng)驗的積累和技巧。比如脫保護劑濃度的選擇很重要，太低脫保護不完全，太高又增加脫嘌呤的機率，還有如何優(yōu)化程序，使蓋帽更充分、更完全等等…。純化方式的選擇，一般說來修飾標記要用HPLC純化，長鏈要用PAGE 純化，但這兩種純化方式都非常費時耗力。